Ph.D.^TM噬菌体展示肽库试剂盒一般技术信息

Q1. 什么是噬菌体展示？

Q2. 噬菌体展示筛选与其他文库筛选方法相比有什么优点？

Q3. Ph.D. 文库能与cDNA文库交换使用吗？

Q4. 有噬菌体展示cDNA 文库吗？

Q5. 在噬菌体展示技术的应用中，M13噬菌体与其他噬菌体比有什么优点？

Q6. pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?

Q7. 含与不含前导肽的pIII蛋白各有多大？

Q8. 文库克隆载体可以买到吗？

Q9. 可以对文库进行扩增以便多做几轮淘选试验吗?

Q10. 有抗-M13的抗体吗?

Q1. 什么是噬菌体展示？ TOP>>
A1.噬菌体展示描述了一种体外筛选技术。在这里，一个小肽或蛋白通过基因工程的方法融合到噬菌体衣壳蛋白上，从而使融合蛋白展示在噬菌体颗粒的外部，而编码融合残基的DNA则位于病毒颗粒内部。展示蛋白与其编码DNA之间的这种物理联系使得我们可以通过一种简单的称为“生物淘选”的体外筛选方法来对大量的蛋白变异株进行筛选，并且每个蛋白都能与其相应的DNA序列联系起来。最简单的生物淘选方法是：将展示不同多肽的噬菌体文库与固定在平板或小珠上的靶分子相互作用，先洗去未结合噬菌体，然后通过破坏噬菌体与靶分子之间的结合作用而洗脱特异性结合的噬菌体。这些被洗脱的噬菌体然后再经体内扩增，重复上述结合洗脱过程，使那些能展示最紧密结合肽序列的噬菌体得到逐步的富集。这样经过3轮筛选/扩增循环后，DNA测序鉴定所得克隆的特征。

Q2. 噬菌体展示筛选与其他文库筛选方法相比有什么优点？ TOP>>
A2.与其它技术相比，噬菌体展示技术的主要优点是容易对库容量较大的文库进行筛选。标准的cDNA文库筛选（如：在λ噬菌体中表达的文库），受噬菌斑数目或能通过杂交筛选的克隆数目的限制，通常只能达到10⁴个数量级。合成随机肽库的筛选，或在针格（定位）上进行（这时通过位置来鉴定结合序列）；或在悬液中的小珠上进行（这时通过测序粘附到所选择的小珠上的Tag序列来鉴定结合肽序列）。这些技术也都将最大可筛选随机肽序列限制在10³-10⁴个数量级范围内。如果在液相中对合成肽序列进行筛选，文库可以含多至10¹⁵个不同的序列，但这种方法需要大量的材料进行测序（~1 μg 多肽），这样在结合步骤中就只能使用低严格强度的条件，从而对目的序列的富集程度也只能达到100-1000倍，结果便会选择到许多具有各种不同程度亲和力的肽序列。而用噬菌体展示技术，可以很容易地对多样性大于10⁹的文库进行筛选，同时由于被筛选的噬菌体库还可以在大肠杆菌中进行再扩增，从而便可以进行连续多轮的迭代选择，得到高亲和力的序列。

Q3. Ph.D. 文库能与cDNA文库交换使用吗？ TOP>>
A3.选择文库的依据在于：你的目的是要鉴定能与靶分子紧密结合的序列，无论天然的还是合成的都可以；还是只是想鉴定靶分子的天然体内配体序列。记住，Ph.D.试剂盒是基于完全随机的肽库序列，而cDNA表达文库则局限于天然存在的蛋白序列。因此，Ph.D.文库最适合于筛选鉴定新配体（如：受体拮抗剂）或测定两个已知蛋白间的相互作用位点（如：测定某一抗体的抗原决定簇序列）。由于生物淘选是在体外进行的，所以所选序列与靶分子的天然配体序列可能会有很少的类同之处，当常规鉴定某一蛋白质的天然配体时，酵母双杂交系统、Lambda gt11系统或其它cDNA文库或许会更合适。

Q4. 有噬菌体展示cDNA 文库吗？ TOP>>
A4. 目前，我们还不知道有商品化的预制噬菌体展示cDNA文库。一般说来，M13噬菌体不适合于进行cDNA表达，因为这种表达需要使目的蛋白序列在前导序列（蛋白分泌所需要的）和噬菌体包膜蛋白pIII或pVIII的N端序列之间保持读码框架符合一致，故插入片段的两端必须都与读码框相符（p=1/9）并且读码框内不含终止密码子（p=[61/64]n/3，n是插入片段的平均长度，以碱基对数表示），才能使相应的插入蛋白序列正确地融合到噬菌体包膜蛋白上。这样产生的M13 cDNA文库中，能有效表达的克隆会非常少。相反，Novagen的T7 Select噬菌体展示系统(1-800-526-7319)却可以将cDNA插入片段融合在包膜蛋白的C末端，该系统利用的是裂解性噬菌体T7而不是溶源性噬菌体M13。但自98年3月起，Novagen公司便不再提供用此载体预制的cDNA文库。

Q5. 在噬菌体展示技术的应用中，M13噬菌体与其他噬菌体比有什么优点？ TOP>>
A5. M13噬菌体和与其密切相关的丝状噬菌体fd和f1均为非裂解性噬菌体，它们在增殖期间均不裂解宿主菌。这就极大地简化了每轮淘选过程之间的中间噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。而其他用于噬菌体展示的噬菌体如：T7, T4和Lambda噬菌体均为裂解性噬菌体，每轮淘选之间都需要花时间进行纯化，以避免淘选扩增的噬菌体污染有细胞蛋白（如：有些蛋白酶类物质会在淘选时将靶分子降解掉）。

Q6. pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同? TOP>>
A6. 丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每个病毒子含５个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。而对主要包膜蛋白pVIII来说，每个病毒子含～2700个拷贝之多，其中约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。这样，以pIII融合子方式表达的多肽便是低价的（每个病毒子1~5个拷贝），而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200个拷贝）。这种高价pVIII展示所增加的亲和力／性有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。

Q7. 含与不含前导肽的pIII蛋白各有多大？ TOP>>
A7. 未加工的包膜蛋白pIII（含前导肽序列但不含展示肽的pIII蛋白）的分子量为44651 Da。不含前导肽序列的成熟pIII蛋白分子量为42579 Da。然而，进行SDS-PAGE电泳时，pIII通常跑在分子量60-65 KDa附近，可能是因为该蛋白不同功能域之间含有特殊的甘氨酸富集的间隔区域［van Wezenbeek et al. (1980) Gene 11, 129-148］。前导肽的氨基酸序列是MKKLLFAIPLVVPFYSHS (注意起始甲硫氨酸Met是由密码子GTG编码的)。

Q8. 文库克隆载体可以买到吗？ TOP>>
A8.用来构建所有这三种Ph.D.文库的载体，M13KE，是可以购买到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端构建了限制性酶切位点，用户可以将设计好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此处构建自己的肽库。因为M13KE是噬菌体，而不是噬菌粒载体，所以在已加工病毒子上的所有5个拷贝的pIII蛋白均携带有展示肽序列。另外，大于20-30个残基的展示多肽会影响噬菌体的感染力，所以此载体仅适合展示短的多肽，而不能展示大的蛋白分子或cDNA文库。在NEB网站<http://vent.neb.com/ftp_info/data_files/sequences/m13ke.seq>上可获得载体序列。
该载体仅做研究用，作为产品# E8101SC Ph.D. Peptide Library Cloning System的一部分提供。除载体外，产品# E8101SC中还含有一扩增引物用来合成随机文库中插入片段的第二链，以及在M13KE中构建随机肽库的详细使用说明书。

Q9. 可以对文库进行扩增以便多做几轮淘选试验吗? TOP>>
A9. 强烈建议不要对产品中所提供的原始文库进行扩增，因为体内序列偏性现象很可能导致某些序列在扩增后的文库中所占比例大大降低，甚至完全缺失。在Ph.D.文库中，展示肽与包膜蛋白pIII融合表达，pIII蛋白通过与受体细胞的性纤毛（F-pilus）结合来调整感染性，这样在体内扩增过程中某些特定的展示序列就被生理选择淘汰，特别是携带有多个正电荷的序列（抑制分泌）和带有未配对半胱氨酸的序列。所提供的每种文库都是在连接后仅扩增了一次，文库所有的特征（代表性的测序数据，淘选数据等）都是在这个扩增销售贮存液的基础上进行的，一旦进行再扩增，我们便不能保证每种文库中所报道的氨基酸分布数据依然成立。

Q10. 有抗-M13的抗体吗? TOP>>
A10. 我们推荐使用下面的抗-M13抗体，这两种抗体均可以从Pharmacia公司（800-526-3593）购买到。这两种抗体均为多克隆抗体，主要识别pVIII抗原