| 快速连接™ 试剂盒 (The Quick Ligation™ Kit ) |
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产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。
应用：
- DNA片段克隆入载体
- 文库构建
- TA克隆
- Linker连接
- 线性DNA的再环化
快速连接试剂盒的优点：
- 快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成
- 方便-可在室温条件下进行连接反应
灵活-适合于各种常规连接反应
连接进程 ( 0-15 分钟)
连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。
试剂盒成分：
- Quick T4 DNA 连接酶(重组酶)
- 2X Quick Ligation Buffer
贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%甘油。
2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM ATP，15%Polyethylene
glycol(PEG 6000)*， pH 7.6@25°C。
* 美国专利号：4,582,802。
注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。
质量控制：通过检测转化效率来检测快速连接试剂盒，按以下步骤进行。
LITMUS28载体经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。所得连接产物直接进行转化实验。
每批产品检验均达到下面的标准：
| 转化效率(转化子/ µg) | ||
| 载体再环化 | 插入片段的连接 | |
| 粘性末端 | > 5 X 106 | > 1 X 106 |
| 平滑末端 | > 2 X 106 | > 1 X 106 |
| 未切割载体 | 2 X 107 | |
快速连接步骤:
- 混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 µl。
- 加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。
- 加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。
- 稍事离心，室温 (25°C) 作用5分钟。
- 冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。
- 不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。
转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：
- 冰上融化感受态细胞。
- 在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 µl)的连接混合物冷却。
- 在DNA样品中加入50 µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。
- 冰上放置30分钟。
- 37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。
- 加入950 µl室温培养基，37°C温育1小时。
- 取100 µl样品铺在适宜的培养基上。
- 37°C培养过夜。
注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。
待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2× Quick Ligation Buffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 µl。DNA片段体积大于10 µl的，则相应增加2× Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。
为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。
电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。
实验方案及应用示例：质粒的再环化：用50 ng不含插入片段的线性载体通过快速连接程序进行。
示例：LITMUS 28克隆载体经Hind III消化后，反应混合物65°C温育20分钟使内切酶失活，然后用快速连接程序使DNA再环化并进行转化实验。
| 载体: | 2.5 µl (50 ng) |
| 插入片段: | 无 |
| 水: | 7.5 µl |
| 2X Quick Ligation Buffer: | 10 µl |
| Quick T4 DNA连接酶: | 1 µl |
| 结果 (转化子/ µg): | |
| 对照质粒(未切割) | 1.3 X 107 |
| 线性化质粒 | 1.1 X 104 |
| 再环化质粒 | 2.1 X 107 |
粘性末端插入片段的连接：以50 ng线性去磷酸化的载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行。
示例：λDNA经Hind III消化后，两个 2kb片段经胶回收方法共纯化，插入到经Hind III切割并去磷酸化的pUC19载体上，通过快速连接程序连接DNA片段并转化。
| 载体: | 3.3 µl (50 ng) |
| 插入片段(3:1): | 4.9 µl (122.5 ng) |
| 水: | 1.8 µl |
| 2X Quick Ligation Buffer: | 10 µl |
| Quick T4 DNA连接酶: | 1 µl |
| 结果 (转化子/ µg): | |
| 对照质粒(未切割) | 2.0 X 107 |
| 不含插入片段的载体 | 1.1 X 105 |
| 载体 + 插入片段 | 2.1 X 106 |
平滑末端插入片段的连接：用50 ng线性去磷酸化载体和3倍摩尔量的插入片段通过快速连接程序进行该实验。
示例：以λDNA为模板，通过PCR方法获得两端含EcoR V酶切位点的1.9 kb片段，经EcoR V消化后产生平滑末端，然后插入到经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体上，DNA片端通过快速连接程序连接并转化。
| 载体: | 2 µl (50 ng) |
| 插入片段(3:1): | 1.7 µl (103 ng) |
| 水: | 6.3 µl |
| 2X Quick Ligation Buffer: | 10 µl |
| Quick T4 DNA连接酶: | 1 µl |
| 结果 (转化子/ µg): | |
| 对照质粒(未切割) | 1.1 X 107 |
| 不含插入片段的载体 | 5.0 X 103 |
| 载体 + 插入片段 | 1.4 X 105 |
Linker 的连接：用50-250 ng平滑末端DNA和20倍过量的Linker通过快速连接程序进行该实验。如果需要，可以按比例调整该程序以进行大批量DNA连接。
示例：通过快速连接程序，将经EcoR V消化并去磷酸化的LITMUS 28载体与包含有Hind III酶切位点的Linker (8 bp)相连。连接产物纯化后，Hind III消化，然后再纯化并用快速连接程序环化。
| 载体: | 6.7 µl (1 µg) |
| Linkers (20:1): | 3.5 µl (20 pmols) |
| 水: | 34.8 µl |
| 2X Quick Ligation Buffer: | 50 µl |
| Quick T4 DNA连接酶: | 5 µl |
| 结果 (转化子/ µg): | |
| 对照质粒(未切割) | 6.2 X 106 |
| 不含linkers的载体 | 3.0 X 103 |
| Hind III 切割的载体 | 3.9 X 106 |
| 载体 + linkers | 2.0 X 105 |
末端摩尔浓度的计算：摩尔浓度=[( µg/ µl)÷(碱基对×650道尔顿)]×2个末端
举例：
- 计算一个浓度为250 ng/ µl的5 kb线性化载体的末端摩尔浓度：
[(0.25 µg/ µl) ÷ (5000 X 650 daltons)] X 2 = 154 nM - 如果将50 ng这个载体加入到20 µl连接反?µ逑抵校偌扑隳┒四Χǘ龋?
50 ng ÷ 20 µl = 0.0025 µg/ µl
[(0.0025 µg/ µl) ÷ (5000 X 650)] X 2 = 1.54 nM
- 要达到3:1的插入片段：载体比例，计算一下需加多少1 kb的插入片段：
3 X 1.54 nM = 4.62 nM
[(? µg/ µl) ÷ (1000 X 650)] X 2 = 4.62 nM
0.0015 µg/ µl X 20 µl = 0.03 µg = 30 ng - 这个反应处在1-10 µg/ml的最适范围内吗？
(50 ng vector + 30 ng insert) ÷ 20 µl = 4 µg/ml