T7 核酸内切酶 I ( T7 Endonuclease I )

• 新的野生型T7核酸内切酶I，能高效切割错配DNA
• 重组蛋白
• 识别不完全配对DNA
• 随酶提供10X 反应缓冲液

概述: T7核酸内切酶I识别并切割不完美匹配的DNA、十字形DNA 结构、Holliday结构或DNA分叉点以及异源二聚体DNA；也可以切割带有切刻位点的双链DNA，只是速度较慢。在距错配位点5′端的第一、第二或第三个磷酸二酯键处进行切割。该酶蛋白是T7噬菌体基因3的产物。

来源：首先用IMPACT-TWIN蛋白纯化系统纯化与MBP融合表达的截短型无活性T7核酸内切酶I(tT7 Endo I)，该融合蛋白的C-端带有硫酯键。然后体外合成一段合成肽，其中含有被前者截下来的氨基酸，将该合成肽与融合蛋白的C-端硫酯键相连接(1)，形成全长具有活性的T7核酸内切酶I。最后，再用因子Xa将MBP融合头切去，纯化得到全长的野生型T7核酸内切酶I。

应用：

• 分解四方向交叉DNA或分支DNA
• 检测或切割异源二聚体DNA和切刻DNA
• 随机切割线性DNA进行shot-gun克隆

随酶提供试剂：NEBuffer 2 (10X)，pUC(AT)。

反应条件：1X NEBuffer 2，37°C温育。

1X NEBuffer 2:
10 mM Tris-HCl
50 mM NaCl
10 mM MgCl2
1 mM DTT
pH 7.9 @ 25°C

单位定义：在50 μl 反应体系中，37°C 1小时条件下，能使 1 μg 超螺旋十字形pUC(AT) DNA > 90%的转变为线性形式所需要的酶量定义为一个单位。

浓度：10,000 units/ml。

贮存条件：20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.15% Triton X-100和50%甘油(pH 7.5 @ 25°C)。-20°C贮存。

注意: pUC(AT)源自pUC19 DNA，只是在其EcoR I和Pst I位点之间的多克隆位点序列已被修改。

使用注意：

• T7核酸内切梅 I是一种结构选择性酶。能作用于多种DNA底物，但是特异性活性不同。因此，当切割某一特定底物时，控制好酶的用量和反应时间是非常重要的。
• 避免反应温度超过42°C，因为这会导致非特异性核酸酶活性的增强。

质量控制

质保声明：无核酸外切酶或其他核酸内切梅的污染。

连接反应：在400 μl 反应体系中，将16 μg Hae III消化的ΦX174 DNA和40单位T7核酸内切酶I于37°C条件下作用２小时，然后，乙醇沉淀DNA， T4 DNA连接酶进行连接反应；之后，再用Hae III重新切割，> 95%的 T7核酸内切酶I处理片段被连接，其中＞ 95%的可被Hae III重新切割。

每一批产品的质量控制数据均可以在随产品附带的说明书中查到。

参考文献：

• Xu, M. -Q. and Evans, T.C. (2001) Methods, 24, 257-277.
• Parkinson, M.J. and Lilley. D.M.J. (1997) J. Mol. Biol., 270, 169-178.
• White, M.F. et al. (1997) J. Mol. Biol., 269, 647-664.
• Hadden, J.M. et al. (2001) Nat. Struct. Biol., 8, 62-67.