| RheoSwitch™ 哺乳动物诱导表达系统
(精确控制哺乳动物细胞中的基因表达) |
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概述: RheoSwitch哺乳动物诱导表达系统能在最大限度控制哺乳动物细胞的基因表达。类似一种调控系统，RheoSwitch可诱导并且控制基因的表达。这种精确控制基因的表达是通过以下两个蛋白质的高度相互特异性作用而达到的，一个是合成诱导物，在RheoSwitch系统中作为配体RSL1；另一个是由二部份嵌合在一起组成的核受体。该受体当有配体RSL1出现时被激活，而基因表达水平可通过调节细胞培养液中配体RSL1的浓度而达到。
RheoSwitch技术与其他诱导系统比较有诸多优势。它的精确调控是其他哺乳动物表达系统所不能比拟的。在没有诱导物的情况下，其本底表达可忽略不计。而当加入配体RSL1时，诱导表达高达1万倍。不像其他系统依赖于类固醇或其他药物，合成的配体RSL1对哺乳动物细胞无其他作用，并且与内源性的转录因子也无交叉应答反应。另外，RheoSwitch系统也不需要特殊的培养液。
应用：
- 诱导蛋白质的表达
- 表达毒性基因
- 研究过量表达和突变救援
特点：
- 能精确调控表达水平
- 基础表达可忽略不计
- 人工合成的诱导物和通过基因工程构建的受体消除了非特异性的负作用
试剂盒组成：
RheoSwitchTM哺乳动物诱导表达系统包括能在哺乳动物细胞培养中表达基因所需要的质粒和诱导配体。试剂盒应贮存于－20°C。
载体：
pNEBR-R1（500 μg/ml）20 μg
表达一种通过基因工程构建的核受体，该核受体是由Rheo受体－1和Rheo激活物两个蛋白质构成异源二聚体后形成完整的全受体，能控制克隆在表达载体pNEBR-X1中的基因表达。两个蛋白质分别受UbC和UbB启动子控制表达。该载体还携带有受控于SV40早期启动子的新酶素抗性基因，可用于稳定细胞株的建立。
pNEBR-X1（500 μg/ml）20 μg
用于目的基因的克隆。该载体在TATA box的上游，有5个拷贝的GAL4应答元件（5X RE）和一个短小前导序列，然后是多克隆位点和SV40 polyA信号。
pNEBR-X1GLuc（500 μg/ml）20 μg
用于分析表达的阳性对照。该载体表达能分泌的Gaussia荧光素酶。
诱导物：
RheoSwitchTM配体RSL1（5 nM溶于DMSO）50 μl
序引物：
RheoSwitch R-X1测序引物
5’(GGGTATATAATGGGGGC) 3’200 pmol
该引物可用于检测插入pNEBR-X1载体的基因正确性。本品是三乙基铵盐（triethylammonium salt）的冻干粉。
荧光素酶检测试剂：
GLuc 底物（100X）50 μl
GLuc Assay Buffer 5 ml
背景资料
RheoSwitch系统是新一代的哺乳动物细胞基因诱导表达系统。它是由一种通过基因工程构建的核受体和具有高度特异性的合成配体诱导物组成。该系统是建立在一种双杂交转换模式上的，当有诱导物呈现时，基因转录被激活，而无诱导物时，转录受到抑制。（1和未发表的观察结果）。合成的受体是由Rheo受体－1和Rheo激活物两个蛋白质组成，这两个蛋白质在形成二聚体后组成了一个完整的全受体，两部份都能在pNEBR-R1质粒上的强启动子下表达。Rheo受体－1蛋白质作为由基因工程构建的配体结合功能域（LBD），是由昆虫EcR核受体（为类固醇受体的一员）融合有酵母GAL4 （一种真核生长转录因子）DNA结合结构域而构成的。Rheo激活物蛋白质是由昆虫和哺乳动物RXR（视黄素X受体）杂交的LBD，融合有病毒激活结构域VP16（是一种常用的易于研究的病毒转录子）组成。将欲表达的基因克隆于pNEBR-X1质粒中，使其受控于GAL4应答元件的5个相连重复序列（5X RE）。在无配体RSL1呈现时，受体通过与GAL4元件结合形成转录未激活形式来抑制转录。但是，一旦有配体RSL1出现时，RSL1就会紧密结合到Rheo受体－1蛋白质上，并且改变其构象，（Rheo受体－1的作用是稳定5X RE上的以异源二聚体形式组成的全受体）。被激活的全受体和VP16激活结构域结合，并且召集来启动子转录辅助因子及其他基础元件，最终进入高度诱导的转录状态（图2）。
上述高度诱导转录与极低的基础表达共同导致了极高的诱导水平（大于1万倍的诱导），表达的控制程度也远高于其他系统。
配体RSL1能从pmol到mmol的浓度范围内诱导转录，（图3），并且在诱导后短短1小时内即可以检测到表达，在48到72个小时达到表达高峰（图4）。RheoSwitch系统对配体RSL1呈高度依赖性，若从培养液中去除RSL1，基因的表达很快终止（图5）。
配体RSL1是一种被称为二酰基肼（diacylhydrazine）的合成物，其化学分子式为：N-(2-ethyl-3-methoxybenzoyl)-N′-(3,5-dimethylbenzoyl)-N′-tert-butylhydrazine（图1）（1）。属于一类化学物家族中的一员，已证实其作用类似于非类固醇类蜕皮激素的激动剂，也有基因诱导功能（2，3）。RSL1选择性地与Rheo受体－1结合，改变其构象，使其释放结合的负性调控辅助因子，稳定Rheo受体－1/Rheo激活物异源二聚体。RSL1不是类固醇，所以不被哺乳动物的核受体所识别，实验证明，到目前为止所检测过的细胞株都不识别。因此，这是一个诱导系统，能特异性地控制目的基因的表达，而不引起宿主菌的其他副作用。
图1：RheoSwitch系统中配体RSL1的化学结构式
图2：应用RheoSwitch系统控制转录。“OFF”状态：当无配体RSL1时，Rheo受体－1和Rheo激活物呈现无活性构象，转录被关闭。“ON”状态：当有配体RSL1时，两个蛋白质形成稳定的二聚体并且与pNEBR-X1质粒上的应答元件结合形成有活性的构象，转录被开启。
图3：不同浓度的配体RSL1诱导荧光素酶的表达。将pNEBR-X1和pNEBR-R1质粒共转染于NIH3T3细胞中，萤火虫荧光素酶的诱导表达随所示RSL1的浓度而变化。表达量的检测是于诱导后48小时进行的。
图4：诱导时间。将pNEBR-R1和pNEBR-X1GLuc（对照）质粒共转染于NIH3T3细胞中，用RSL1诱导表达。诱导后1至24小时检测Gaussia荧光素酶的活性。
图5：循环加入和去除RSL1两次，观察表达的快速开启与关闭。将pNEBR-R1和pNEBR-X1质粒共转染于NIH3T3细胞中，用RSL1诱导表达并于诱导后24小时去除，观察萤火虫荧光素酶的不稳定表达。第二次加入和去除RSL1后出现新的表达开启与关闭反应。为了去除RSL1和关闭基因表达，用不含RSL1的培养液在所示时间内清洗细胞。蓝色的线是诱导表达，红色的线是未诱导的表达。
Gaussia荧光素酶对照报告基因
RheoSwitch哺乳动物诱导表达系统提供对照报告质粒（pNEBR-X1GLuc），它编码有一种分泌性荧光素酶。GLuc是一种分离于海洋桡脚类动物的新型荧光素酶 (4)。该荧光素酶不需要ATP来催化底物腔肠素的氧化反应，在470 nm能发光，与其他发光报告基因相比有许多优势。
GLuc对照报告基因的特点如下：
- 携带有天然分泌信号，在表达时分泌进细胞培养液中，易于检测。
- 比海肾（Renilla）和萤火虫的荧光素酶的信号高一千倍。
- 同次转染的细胞可检测多次，例如：在不同的时间段。
- 经过“最优编码”处理，适于在哺乳动物细胞中表达。
- 分泌的蛋白质不仅稳定并且发光活性高，适用于要求非常灵敏的检测。
参考文献：
- Palli, S.R., Kapitskaya, M.Z., Kumar, M.B. and Cress, D.E. (2003) Eur. J. Biochem., 270, 1308-1315.
- Dhadialla, T.S., Carlson, G.R. and Le, D.P. (1998) Annu. Rev. Entomol., 43, 545-569.
- Kumar, M.B., Potter, D.W., Hormann, R.E., Edwards, A., Tice, C.M., Smith, H.C., Dipietro, M.A., Polley, M., Lawless, M., Wolohan, P.R., Kethidi, D.R. and Palli, S.R. (2004) J. Biol. Chem., 279, 27211-27218.
- Verhaegent, M. and Christopoulos, T.K. (2002) Anal. Chem., 74, 4378-4385.
可单独出售的试剂盒成份:
RheoSwitchLigand RSL1
#E3301S 0.125 ml (5 mM) 2,700.00元
#E3301L 0.625 ml (5 mM) 10,800.00元
pNEBR-X1
#N8078S 20 μg 3,300.00元
pNEBR-R1
#N8079S 20 μg 3,300.00元
pNEBR-X1Gluc
#N8080S 20 μg 3,300.00元
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