• 高水平表达重组蛋白质

• 随试剂盒提供K.lactis感受态细胞

• 流程便于操作，适于不熟悉酵母系统的使用者

• 能商业授权

概述: K.lactis蛋白质表达试剂盒提供了一种在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中表达目的基因的简便方法（图1）。由试剂盒所提供的整合表达载体pKLAC1（图3）制备非分泌或分泌性蛋白质。为了使蛋白质得以分泌表达，目的基因被克隆到pKLAC1上的K.lactis α结合因子（α Mating Factor，α-MF，图4）的下游，α-MF最终将在高尔基体上被剪切以使目的蛋白质分泌表达（图1）。

K.lactis蛋白质表达系统具有其它酵母和细菌表达系统所不能比拟的优势。首先，由于乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）能够很快达到高密度培养并且能大量制备重组蛋白质，所以在食品工业方面利用K.lactis进行大规模生产蛋白质的历史已有十几年（图2）。其次，酵母表达由突变的强启动子LAC4调控，该启动子经修饰后在大肠杆菌中无背景表达（1）。因此，对大肠杆菌有毒性的基因在酵母表达之前，可先克隆至细菌中的pKLAC1。再有，试剂盒提供了高效的K.lactis感受态细胞，对于不熟悉酵母操作的使用者表达也显得简单易行。高效的转化效率使得该系统适用于需要大量转化子的情况，例如，利用cDNA文库进行表达克隆。酵母转化子的筛选属于非抗生素筛选， pKLAC1表达的乙酰胺酶（amdS）可以使已转化的细胞在特定培养基上利用唯一氮源乙酰胺。乙酰胺的筛选也提高了含有多拷贝细胞的数量，以便获得更高产量的蛋白质。最后，在K.lactis细胞中表达的蛋白质可以进行真核蛋白质所需的折叠和糖基化，而在大肠杆菌细胞中则不能进行这一过程，这使得它成为细菌表达系统的重要替代。

图1：蛋白质的分泌过程。在细胞核中，编码有α-MF结构域（蓝色）和目的重组蛋白质（黑色）的DNA与酵母基因组整合。PLAC4-PBI启动子调控表达。一旦融合蛋白质开始表达，位于α-MF上的信号肽就会指导融合蛋白质转运到内质网（ER）膜上，在此信号肽酶（SP）将信号肽切除。分泌小泡（环形）将融合蛋白质转运至高尔基体， Kex 蛋白酶在此将α-MF结构域切除，释放成熟的目的蛋白质。随后，目的蛋白质通过分泌小泡运输到质膜（PM），从那分泌到胞外。

图2：聚丙烯酰胺凝胶电泳显示分泌重组麦芽糖结合蛋白（MBP）及考染检测分泌MBP。泳道1：蛋白分子量Marker；泳道2：野生型K.lactis培养液（15 μl）；泳道3：整合有大肠杆菌malE 基因表达框的K.lactis细胞培养液（15 μl）。

优点：

●高水平表达重组蛋白质

●快速高密度细胞生长

●大肠杆菌克隆中无背景基因表达

●方便、快捷的细胞转化步骤

●无需昂贵的抗生素

●能商业授权

试剂盒组分：

K.lactis GG799 感受态细胞

整合鉴定引物

NEB 酵母转化试剂

NEBuffer 4 （ 10× ）

pKLAC1 载体

pKLAC1-malE 对照载体

Sac II

酵母碳基础培养基

贮存条件

-20℃保存试剂盒组分，-70℃保存感受态细胞

常见问题

• 从哪里可以找到更多的关于K.lactis蛋白表达试剂盒的常见问题及解答

点击该表达系统的“常见问题及解答”，可以找到较为详细的关于K.lactis蛋白表达试剂盒的常见问题及解答。其中包括了表达系统的概述、克隆方案、菌株及感受态细胞、转化和筛选、菌株生长和蛋白表达以及参考文献。

• 何种类型的蛋白质能在K.lactis中表达良好？

酵母细胞能够分泌表达多种蛋白质。总的来说，那些能够被天然宿主分泌表达的蛋白质（如糖苷酶，血清白蛋白，细胞因子等）易于分泌表达。然而，众多参考文献中的实验证明：不同类型的酵母细胞也能分泌表达许多非分泌性蛋白质。因此，当不确定某种蛋白质的表达方式时，最好尝试分泌表达。此外，酵母中胞内表达适用于多种蛋白质，它也是细菌蛋白质表达的主要替代方式。

• 何种启动子调控了K.lactis中外源基因的表达？

表达载体（pKLAC1）含有K.lactis的强启动子LAC4（PLAC4-PBI），该启动子调控目的基因的表达。PLAC4-PBI启动子的最大优点是在大肠杆菌中发生转录沉默。相比较而言，在表达载体转化酵母细胞之前，野生型PLAC4启动子在大肠杆菌中有一定的背景转录活性，这对大肠杆菌中的表达载体的装配和增殖过程有损害作用。特别是当目的基因的编码产物对大肠杆菌细胞有毒害作用时，这一问题尤为严重。因此，pKLAC1更适合编码的蛋白质对细菌有毒性和伤害作用的基因的克隆与表达。

• pLAC4-PBI是一种可诱导/可阻遏的启动子吗？

这依赖于K.lactis菌株的背景。K.lactis中的LAC4位点的糖抑制受到转录激活因子Lac9p（KLGal4p）的调控。菌株与菌株间的Lac9p的表达水平的微小差异显示了PLAC4的糖抑制水平。对于某些实验用K.lactis菌株中，野生型PLAC4在含有半乳糖或乳糖培养基中调控的表达水平比含有葡萄糖培养基中高100倍。然而，在葡萄糖培养基中表达不能被完全抑制。在GG799背景中，PLAC4的糖抑制并不显著，因此降低作为可诱导的启动子的利用。然而，为了使得GG799中目的蛋白质的最大表达，我们推荐在含有半乳糖的培养基中培养细胞。并且，在含有葡萄糖和半乳糖碳源的培养基中，葡萄糖不能抑制GG799细胞中半乳糖诱导的表达。

• 在K.lactis体内，pLAC1是否能以游离质粒的形式进行复制？

不能。pLAC1是一种整合表达载体，当它一旦转化进酵母细胞，此载体插入到K.lactis基因组的LAC4位点的启动子区域。然而K.lactis确实有游离质粒，但是它们会给大规模生产蛋白质带来一些问题。例如，在缺少筛选的情况下，质粒易被细胞丢失。并且大规模发酵，利用抗生素筛选质粒造价昂贵，而利用缺陷型标记筛选又会降低产量（见常见问题#3“菌株和感受态细胞”）。整合表达载体比较具有吸引力，是因为它们插入到基因组中，成为宿主染色体一部分，这样即使在缺少筛选的情况下仍很稳定。

• pLAC1能否用于胞质蛋白质的表达？

可以。目的基因应克隆至pKLAC1中的PLAC4-PBI的下游且缺失α结合因子分泌结构域。这一操作的实现需将基因的5’末端克隆至pKLAC1的单一酶切位点Hind Ⅲ，3’末端克隆至任一多接头位点。由此种方式表达的基因必须以甲硫氨酸作为第一个密码子起始翻译。

• 如何利用乙酰胺进行筛选？

此种筛选属于氮源筛选。细胞转化混合物（含有大量被pKLAC1转化或未转化的细胞）涂于含有5 mM乙酰胺的酵母基本碳源（YCB）培养基上。YCB培养基含有K.lactis细胞生长所需的所有营养物质和碳源，但缺少氮源。只有当乙酰胺被乙酰胺酶（由pKLAC1上的amdS基因表达）降解为氨时，它才能作为氮源被利用。因此，只有转化的细胞才能长成菌落。

图3：pKLAC1表达载体。在pKLAC1（9091 bp）上，LAC4 启动子（PLAC4-PBI）的5'和3'端被编码β-内酰胺酶的基因（ApR）和pMB1的复制原点所隔开，从而使质粒能在大肠杆菌中增殖。K.lactis α- 结合因子分泌引导序列（α-MF）、多克隆位点（MCS）和LAC4转录终止子（TT）位于3' PLAC4-PBI的下游。酵母的PADH2调控乙酰胺酶标记基因（amdS）的表达。用Sac II或BstX I将载体线性化，所产生的线性DNA片段可以插入到K.lactis基因组自身的LAC4启动子位点。

参考文献

• Colussi,P.A. and Taron,C.H. unpublished observations.

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