可单独订购以下相关试

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试剂盒组成：

• 所提供的试剂可在2 ml反应体系中合成2 mg双链RNA
• LITMUS克隆载体（28i 38i）以及对照质粒
• T7 Minimal Primer （19-mer）
• 10×缓冲液/NTPs，无SDS琼脂糖胶上样缓冲液，无RNase污染的水
• 30×高分子量成分混合物(HMW)
• T7 RNA聚合酶 (150 units/μl)
• 2-Log DNA Ladder（100-10,000bp）
• 详细的操作说明书

概述:

HiScribeTM RNAi 转录试剂盒是利用携带两个相反方向T7启动子的克隆载体，在RNA聚合酶的作用下，高效合成用于RNAi实验的双链RNA（1-3）。本试剂盒除提供用于体外高效转录的试剂外，还提供两个LITMUS克隆/双向转录载体，适用于所有的转录反应，包括体外（显微注射、侵浸以及细胞转染）和体内（线虫喂饲）RNAi实验。

本试剂盒还可用于传统的单链RNA合成，从而应用到包括RNA结构研究、核酶生化反应、体外翻译、RNA-蛋白质间相互作用分析、反义核酸技术以及利用SELEX技术发现适配子等研究领域。

体外转录的双链RNA除了应用到线虫RNAi实验外，还可用于昆虫培养细胞和一些哺乳动物细胞的基因敲除实验（4，5）。此外，利用HiScribe试剂盒还可制备短RNA发夹和siRNA片段（6，7）（图3）。而用于制备短RNA发夹和siRNA片段的DNA模板，则可通过两条合成寡核苷酸间的退火获得，其中片段5’端须含有T7启动子序列。

HiScribeTM试剂盒的优点:

• 合成双链长RNA产量高（1 mg/ml）
• 一步反应即可获得双链RNA
• 适用于线虫、果蝇和培养细胞的通用RNAi实验操作方法
• 体外合成发夹RNA或特异性短siRNA片段

方法概述:

采用HiScribe RNAi转录试剂盒合成双链RNA时, 无论体内还是体外都可在T7 RNA聚合酶的作用下，同时转录DNA模板的双链，整个反应可在单管中完成。

体外转录时，克隆有目的片段的载体DNA首先用内切酶酶切，制备每条RNA转录的模板（图1）。然后同时转录两条线性化DNA模板合成预期长度的RNA，除了多克隆位点外，不会含有任何其它载体序列。每次转录反应RNA的产量可达500-1 000μg/ml（图2）。

另外，也可采用T7启动子特异性引物PCR扩增插入片段，制备双链DNA模板（图1）。在体外，以PCR产物为模板，可通过一步转录反应，获得双链RNA。如果针对不同的靶基因设计特异性引物，其末端必须含有T7启动子成分，这样就导致引物序列较长；为克服这个问题，可将靶基因克隆入LITMUS载体，然后采用通用的T7启动子引物PCR扩增该序列。

图1:以克隆入LITMUS 28i载体的基因为模板制备dsRNA

图2: 采用HiScribe RNAi转录试剂盒体外制备单链/双链RNA。 LITMUS 38i含有1.3 kb的荧光素酶插入片段，分别采用插入片段两侧的PspOM I(P)和Stu I(S)进行酶切。线性化的模板分别或一起转录（泳道P和S为分别转录，泳道P/S为混合后转录），获得预期分子量大小的单链和双链RNA产物RNA产量采用琼脂糖凝胶电泳分析，至少为0.5 μg/μl。

参考文献：

• Bass，B.L. (2000) Cell 101,235-238
• Fire, A. (1999) Trends Genet.15,358-363
• Sharp, P.A. (2001) Genes Dev.15,485-490
• Clemens,J.C. et al.(2000) Proc Natl.Acad.Sci.USA 97,6499-6503
• Billy,E. et al.(2001) Proc Natl.Acad.Sci.USA 98,14428-14433
• Donze,O. and Picard,D.(2002) Nucleic Acids Res.30,e46
• Yu,J.-Y. et al.9(2002) Proc Natl.Acad.Sci.USA 99,6047-6052