• 采用野生型M-MuLV反转录酶
• 随酶提供10×反应缓冲液

概述:  本试剂盒用莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）高效合成mRNA的cDNA拷贝。在基因特异性引物存在条件下，此单链cDNA产物可直接用来进行PCR扩增，或进行其它下游操作（图1)。

本试剂盒已经优化使进行逆转录反应的模板总RNA范围可以在10 pg - 2 µg之间。cDNA合成后进行PCR扩增既可检测到长cDNA（>13 kb）片段,也可检测到低丰度cDNAs样品。

本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA第一链所需要的全部试剂，并提供两种cDNA合成引物：oligo-dT(dT₂₃VN)和随机九聚物引物（dN₉），前者经过特别设计可以防止在polyA内部引发链合成。试剂盒中还含有RNase H，可在cDNA合成后除去RNA模板，当进行cDNA合成的模板RNA量少时这一步处理可提高PCR扩增的产量。另外，随试剂盒附送对照总RNA和PCR扩增用阳性对照引物。
注：V=A, G或C; N=A, G, C或T。

试剂盒组成:

• M-MuLV反转录酶
• RNase H
• dNTP混合物，dT₂₃VN引物，随机九聚物引物(dN)₉
• 胎盘RNase抑制剂
• 对照总RNA（鼠肝）
• 对照引物（扩增GAPDH片段）
• 10×RT反应缓冲液，无核酸酶污染的水
• 详细的使用说明

图1：用不同的引物合成第一链cDNA示意图

使用方法:

1. 在无菌管中加入以下样品:
   总RNA 1-10 µl (1 ng-2 µg)
   dT23VN引物 2 µl
   dNTP混合物 4 µl
   加无核酸酶污染水至 16 µl
2. 70°C加热5分钟，短暂离心后置于冰上。
3. 混合以下样品：
   步骤1的RNA/引物/dNTP 16 µl
   10×RT反应缓冲液 2 µl
   RNase抑制剂 1 µl
   M-MuLV反转录酶 1 µl
   总体积 20 µl
4. 42°C温育1小时。
5. 95°C 5分钟使酶失活。
   如果需要用RNase H处理，进行步骤6。否 则，进行步骤7。
6. 加RNase H 1 µl (2 units)，37°C作用20分钟降解RNA。然后95°C 5分钟使酶失活。
7. 用无核酸酶污染水将反应体系稀释到50µl，取2-5 µl进行PCR扩增反应。

阳性对照反应结果见图2:
采用上述标准反应步骤，以1 µl(0.5 µg)对照总RNA为模板合成cDNA，然后从50 µl反应产物中取5 µl进行PCR, 用对照引物扩增GAPDH片段，PCR循环程序如下：
94°C 2 min
94°C 30 sec
55°C 30 sec 25个循环
72°C 30 sec
产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见350 bp大小的清晰条带（图2）。

图2：由不同量对照总RNA起始,PCR扩增GAPDH cDNA片段结果。采用不同的总对照RNA量（从10 pg到2 µg）合成cDNA第一链，然后取1/10体积的cDNA产物进行PCR扩增。50 µl体系，25个循环。每条带上样量15 µl，最后一个样品孔为不加反转录酶的对照反应。分子量标准为250 ng的100 bp DNA Ladder(NEB #N3231)。